Восемь белков вместо четырёх: немецкие учёные нашли способ видеть больше в одной клетке одновременно

Международная исследовательская группа под руководством Медицинского университета Гёттингена (UMG, Германия) разработала метод, позволяющий визуализировать восемь различных белков в одной клетке за один шаг маркировки. Работа опубликована в журнале ACS Nano.

Флуоресцентная микроскопия — незаменимый инструмент биомедицинских исследований. Чтобы увидеть конкретный белок или клеточную структуру, исследователи прикрепляют к ним флуоресцентный краситель — молекулу, которая светится под лазером. Проблема: обычные микроскопы различают лишь три-четыре цвета одновременно — синий/фиолетовый, зелёный, оранжевый/жёлтый и красный. Это значит, что за один раз можно «пометить» не более четырёх разных белков.

Решение: использовать не только цвет, но и время

Команда UMG нашла принципиально иной способ различать флуоресцентные метки. Вместо того чтобы полагаться только на цвет испускаемого света, они используют «время жизни флуоресценции»: промежуток времени (от долей наносекунды до нескольких наносекунд), которое краситель тратит на возвращение из возбуждённого состояния в обычное.

Молекулы одного цвета, но с разным временем жизни флуоресценции выглядят одинаково на обычном снимке — но различимы при анализе в режиме временно́го разрешения (FLIM — fluorescence lifetime imaging microscopy). Это принципиально расширяет «алфавит», которым пользуется микроскоп: вместо четырёх цветов — комбинация цвета и времени, что позволяет кодировать значительно больше различных меток.

Но одного подхода к многоцветной FLIM-микроскопии недостаточно: нужны метки с заранее подобранным, предсказуемым и стабильным временем жизни. Именно здесь ключевая инновация команды UMG: они разработали «наноантительные» метки (nanobody-based labels), в которых специально спроектированные молекулярные «кармашки» изменяют время жизни одного и того же красителя.

По сути: один и тот же краситель, помещённый в разные белковые «кармашки», будет «светиться» с разным временем жизни. Это позволяет кодировать разные белки не разными цветами, а разными «кармашками» для одного цвета.

Что получилось на практике

В результате метод позволил:

• одновременно маркировать восемь различных белков в одной клетке за одну процедуру маркировки;
• использовать стандартные конфокальные микроскопы, уже имеющиеся в большинстве исследовательских лабораторий;
• достичь этого в живых клетках без их фиксации или разрушения.

Восемь белков вместо четырёх — это удвоение информационной ёмкости эксперимента. Для таких задач, как изучение взаимодействия нескольких сигнальных путей, динамики клеточного цикла или одновременного отслеживания нескольких болезнетворных процессов, это принципиально меняет возможности.

Практическое значение для биомедицины

Умение следить за большим числом белков одновременно критически важно для понимания сложных внутриклеточных процессов. Клетки работают не через один или два белка — они используют сотни молекулярных участников, действующих параллельно и взаимозависимо. Метод с восемью метками позволяет делать «снимок» большего числа участников за одну итерацию эксперимента, снижая ошибки из-за различий между разными образцами.

Читайте также: методе наблюдения за структурами живой клетки.

Авторы рассматривают работу как шаг к значительно более широкому мультиплексированию — потенциально к десяти и более белкам в одной клетке, используя комбинации цвета и времени жизни флуоресценции.